2023.05.11
PBMC（外周血单个核细胞）是免疫学功能研究中最常用的细胞模型，如细胞增殖、细胞毒性、细胞因子分泌等。如何精确、快速、简便计数PBMC以及精确分析PBMC活力，是免疫学研究以及免疫治疗领域至关重要的步骤。常规的计数方法有台盼蓝细胞计数、双荧光法AO/PI细胞活率计数。
1. 台盼蓝细胞计数法
台盼蓝（Trypan Blue）是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成蓝色。细胞计数一般用血细胞计数板，便于确定细胞的生长状况。
机理：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。
实验内容与方法:
1. 制备细胞悬液 将细胞用培养基（Thawing Medium）制备成适当浓度的细胞悬液备用，建议使用3ml巴氏吸管混匀细胞。
常规的稀释倍数
2. 染色 取10ul细胞悬液与10ul台盼蓝染液混合。
3. 细胞计数
（1）计数板处理 用无水乙醇或 95% 乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖片覆在计数板上。
（2）加样 从计数板边缘缓缓滴入染色后的悬液，悬液充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。稍候片刻，将计数板放在低倍镜下（10×10 倍）观察计数。
（3）计数方法 按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分 16 个小方格）内的细胞数。
计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。
在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过 ±5%。
镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。
细胞计数公式：活细胞数目=大方格细胞数目平均值x稀释倍数x __ mL =__ x 104
细胞活力公式：活细胞数目÷细胞总数= __%
2. 双荧光法AO/PI
AO/PI试剂由可以发出绿色荧光的DNA结合染料吖啶橙（AcridineOrange，简称AO）和可以发出红色荧光的DNA结合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，简称PI）组成。其中AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光；PI只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。
由于AO和PI为DNA结合染料，因此可有效排除杂质以及红细胞的干扰，确保对样品进行准确计数。
目前台盼蓝计数还是市场上主流的细胞计数方法。但在细胞治疗行业，需要测量复苏时的免疫细胞活率和数量，台盼蓝的技术原理已经不能满足其需求，双荧光AO/PI计数的方法变得越来越普及。
妙顺生物 专注于原代细胞
Peripheral Blood:
Leukopak
PBMC
T Cells
B Cells
Monocytes
Macrophages
DC Cells
NK Cells
More
Cord Blood
CD34+ Stem Cells
CBMC
